Il testosterone libero è la quota di testosterone non legata a proteine plasmatiche (né alla SHBG né all'albumina), che rappresenta l'1-3% del testosterone totale ed è la forma biologicamente attiva che penetra nelle cellule bersaglio e si lega al recettore degli androgeni. La quota legata all'albumina (30-40%), che si dissocia facilmente, è considerata biodisponibile insieme al testosterone libero. Il dosaggio diretto del testosterone libero con il metodo di riferimento della dialisi all'equilibrio è complesso e disponibile solo in laboratori specializzati. I metodi immunologici analogici diretti (molto diffusi) sono inaccurati e non raccomandati. Il metodo più pratico e affidabile è il calcolo del testosterone libero dalla concentrazione di testosterone totale e SHBG utilizzando l'equazione di Vermeulen (calcolatore online disponibile su www.issam.ch). Il testosterone libero è particolarmente utile nelle condizioni che alterano la SHBG: l'obesità, il diabete di tipo 2 e l'ipotiroidismo riducono la SHBG causando un testosterone totale falsamente basso con testosterone libero normale; al contrario, l'invecchiamento, l'ipertiroidismo, la cirrosi, gli anticonvulsivanti e gli estrogeni aumentano la SHBG causando un testosterone totale normale con testosterone libero ridotto. Nell'uomo il testosterone libero calcolato migliora la diagnosi di ipogonadismo nei casi borderline. Nella donna con sospetto iperandrogenismo, il testosterone libero calcolato è più sensibile del testosterone totale.